免疫療法是當下腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點抑制劑應(yīng)用范圍逐漸擴大，CAR-T療法研究不斷出現(xiàn)新的進展，CAR-T療法作為有別于傳統(tǒng)藥物的“活藥”，不僅對復(fù)發(fā)、難治性腫瘤患者表現(xiàn)出了突破性療效，其生產(chǎn)體系和使用場景也有別于普通藥物。鑒于生物技術(shù)的快速發(fā)展，預(yù)計CAR-T療法將帶給人們更多驚喜。

CAR-T療法是什么

CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受體T細胞）療法是指通過基因修飾技術(shù)，將帶有特異性抗原識別結(jié)構(gòu)域及T細胞激活信號的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入T細胞，使T細胞直接與腫瘤細胞表面的特異性抗原相結(jié)合而被激活。T細胞被激活后，一方面通過釋放穿孔素、顆粒酶素B等直接殺傷腫瘤細胞；另一方面通過釋放細胞因子，募集人體內(nèi)源性免疫細胞來殺傷腫瘤細胞，以達到治療腫瘤的目的。同時，還可形成免疫記憶T細胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長效機制。

一個典型的CAR-T治療流程主要分為五個步驟：分離，從癌癥患者外周血中分離純化出自身T細胞；修飾，T細胞激活后，利用基因工程將能特異識別腫瘤細胞的CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入T細胞；擴增，體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細胞至治療所需劑量，一般為十億至百億級別（根據(jù)患者體重和治療周期決定）；回輸，化療清淋預(yù)處理后回輸CAR-T細胞至患者體內(nèi)；監(jiān)控，觀察療效并嚴密監(jiān)測不良反應(yīng)。整個療程持續(xù)3周左右，其中細胞“分離-修飾-擴增”約需要2周。

CAR-T的結(jié)構(gòu)

CAR通常由一個胞外抗原結(jié)合域（如識別CD19的單鏈抗體序列scFv），一個鉸鏈區(qū)（促進抗原受體與腫瘤抗原的結(jié)合），一個跨膜區(qū)（用來固定CAR），一個T細胞激活結(jié)構(gòu)域（CD3ζ，提供T細胞活化的第一信號）以及一個或多個胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域組成（CD28/4-1BB，提供T細胞活化的第二信號）。CAR的胞外抗原結(jié)合域源于抗體的抗原結(jié)合基序，可以連接VH和VL序列構(gòu)建的單鏈可變區(qū)，具有特異性識別某種特定腫瘤相關(guān)抗原的作用。CAR識別腫瘤相關(guān)抗原，隨后通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域活化T細胞，刺激T細胞進行增殖，并發(fā)揮免疫效應(yīng)，釋放細胞因子，溶解腫瘤細胞。

歷經(jīng)十余年，CAR-T經(jīng)歷了四代結(jié)構(gòu)，每一代結(jié)構(gòu)在各個細節(jié)上均有所突破，使CAR-T往更為精準、更為高效、更為持久的方向發(fā)展。T細胞的完全激活一方面依賴于胞外抗原結(jié)合域與抗原的結(jié)合所傳遞的第一信號，另一方面也需要共刺激分子受體與其配體結(jié)合所傳遞的第二信號，而腫瘤細胞表面通常不表達這類共刺激配體。第一代CAR設(shè)計結(jié)構(gòu)相對簡單，在臨床試驗中的效果并不理想。第二代CAR引入一個共刺激結(jié)構(gòu)域CD28或4-1BB，在臨床試驗中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題，并提高了作用持久性。第三代CAR包含兩個共刺激結(jié)構(gòu)域，一個為CD28或4-1BB，另一個為OX40、CD28或4-1BB。相比二代，三代CAR雖然在一些前臨床試驗數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更強、更持久的作用活性，但也有報道指出，三代CAR可能會造成T細胞刺激閾值的降低，引起信號泄露，可能誘發(fā)細胞因子過量釋放。

由于腫瘤細胞具有異質(zhì)性，一部分腫瘤細胞不具有可被T細胞特異性識別的抗原，無法被傳統(tǒng)的CAR-T細胞識別并清除。這一問題或可通過四代CAR-T技術(shù)，募集除T細胞以外的免疫細胞至腫瘤所在區(qū)域來解決。四代CAR-T細胞又被稱為TRUCK T細胞，含有一個活化T細胞核因子（NFAT）轉(zhuǎn)錄相應(yīng)元件，可以使CAR-T細胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細胞因子（目前主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環(huán)境，募集并活化其他免疫細胞進行免疫反應(yīng)。目前，四代CAR-T療法已經(jīng)在包括神經(jīng)母細胞瘤在內(nèi)的實體瘤中開展臨床試驗。

第二代CAR-T有較多的臨床數(shù)據(jù)支持，穩(wěn)定性高且技術(shù)工藝較為成熟，是目前的主流技術(shù)。未來，隨著新結(jié)構(gòu)在臨床上的試驗推廣及生產(chǎn)工藝的改進，第三代、第四代CAR-T產(chǎn)品更為優(yōu)良的療效值得期待。

CAR-T的靶向抗原

CAR-T技術(shù)是靶向某一種抗原，而不是針對單一腫瘤疾病，因此靶點的選擇是CAR-T有效性和安全性的基礎(chǔ)。CAR-T靶向的腫瘤抗原可分為兩類：一類是腫瘤特異性抗原，是最理想的抗原。靶點抗原的特異性越高，CAR-T細胞就可越專一地針對特定的腫瘤細胞，對正常細胞不作用，從而降低不良反應(yīng)。但這種理想的抗原不多，目前受到關(guān)注的有表皮生長因子受體EFGRvIII和前列腺特異性膜抗原PSMA等。還有一類是腫瘤相關(guān)抗原，其在腫瘤細胞表面過度表達，在正常組織中低表達，目前大部分應(yīng)用的腫瘤抗原靶點都是這種。

目前應(yīng)用于臨床最成功的案例是以CD19為靶點構(gòu)建的CAR-T，但其適應(yīng)證局限在B細胞相關(guān)的血液腫瘤中，如B系淋巴細胞白血病（急性、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤等）。

據(jù)Cell Trials的統(tǒng)計，截至2017年10月，全球大約50%的CAR-T臨床試驗針對CD19靶向抗原，另有一小部分（約6%）使用的是由CD19與另一抗原組成的組合抗原。除了CD19，CAR-T在血液腫瘤治療方面還有許多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20較為常見。BCMA正在成為CAR-T治療的熱門靶點。

2018年中國腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，我國發(fā)病率最高的前10種癌癥均為實體瘤，占全部癌癥的比例高達77%。但實體瘤靶點的研發(fā)較為困難，相關(guān)研發(fā)任重道遠。目前針對實體瘤，以間皮素為靶點的CAR-T臨床試驗數(shù)量最多，針對磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點治療肝癌、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）靶點治療神經(jīng)母細胞瘤以及針對CEA靶點治療腸癌的CAR-T療法也受到了廣泛關(guān)注。

CAR-T結(jié)構(gòu)中抗體scFv的篩選

CAR是以抗體的scFv（單鏈可變區(qū)）識別腫瘤抗原的，所以CAR-T的研發(fā)需要獲取和篩選單抗。篩選出親和力高的單抗后，將相應(yīng)的雜交瘤細胞凍存?zhèn)鞔纬煞€(wěn)定的細胞株，用于CAR結(jié)構(gòu)中scFv序列的構(gòu)建。

scFv由重鏈、輕鏈以及之間的linker連接而成，所以將不同的重鏈和輕鏈隨機組合，可以建成人源化的scFv組合抗體文庫，再通過表達量、穩(wěn)定性、與抗原的親和力等指標進行篩選。高通量篩選主要通過噬菌體展示技術(shù)。該技術(shù)最大的優(yōu)點是直接將表達出來的抗體與其基因型聯(lián)系在一起，再利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，將感興趣的抗體挑選出來。通過噬菌體技術(shù)，可高效獲得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

scFv序列是CAR-T研發(fā)中的核心技術(shù)，從華創(chuàng)證券的調(diào)研信息來看，篩選一個合適的scFv序列，時間成本和費用成本都不低，鼠源性的成本在幾十萬元，人源化的則需要上百萬元。目前很多科研機構(gòu)使用的序列是從文獻上獲取的，原則上只能用于科研。所以如果要做創(chuàng)新型CAR-T并進行商業(yè)化，則需要科研機構(gòu)或企業(yè)自主研發(fā)篩選。

CAR-T的轉(zhuǎn)染載體與制備工藝

為實現(xiàn)CAR在T細胞上的表達，需要通過載體將CAR基因?qū)隩細胞。理想的載體應(yīng)該具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性好，不引起機體免疫反應(yīng)等特點。目前有多種載體用于CAR-T細胞產(chǎn)品制備，包括病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)（如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉(zhuǎn)染（如轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染、mRNA電穿孔轉(zhuǎn)染）等，雖然已開展的臨床試驗以病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式為主，但以非病毒載體轉(zhuǎn)染的方式也在獲得青睞。

慢病毒載體是目前應(yīng)用最多的載體系統(tǒng)。病毒基因轉(zhuǎn)移載體的主要優(yōu)點是制造、生產(chǎn)相對容易，并且能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)穩(wěn)定整合到宿主基因組中。但病毒載體的致病性和潛在的插入誘變可能性在人類臨床試驗中存在顯著的監(jiān)管障礙，所以非病毒載體的開發(fā)顯得十分重要。轉(zhuǎn)座子和mRNA電穿孔技術(shù)是目前研究比較多的兩類非病毒載體系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子最終可能發(fā)展成多功能T細胞基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，但目前的DNA電穿孔方法通常產(chǎn)生較差的細胞活力，臨床應(yīng)用中需要擴大T細胞培養(yǎng)，以產(chǎn)生大量 T 細胞。mRNA電穿孔被認為是目前最安全的T細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，其可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止或增殖緩慢的T細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率多在90%以上，且設(shè)計相對容易，性價比高。臨床上已經(jīng)使用利用瞬時mRNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的CAR-T細胞，然而，這種方法需要幾輪CAR-T細胞輸注。在臨床前模型中，mRNA電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向間皮素的CAR-T能引起播散性間皮瘤異種移植物的消退，然而，在灌輸49天后一名患者出現(xiàn)了過敏反應(yīng)。

CAR-T細胞的制備需要一些小心操作的步驟，而且整個過程中都需進行質(zhì)量監(jiān)控測試。CAR-T的GMP制備工藝主要包括：T細胞收集和分離、T細胞激活和修飾、T細胞擴增、T細胞收獲與回輸。生產(chǎn)過程通常需要5～10天，從收集到回輸需要2～4周（根據(jù)患者的臨床狀態(tài)和化療預(yù)處理方案確定）。

CAR-T細胞制造是一個非常復(fù)雜的過程，制造難、成本高已經(jīng)成為行業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。目前，吉利德和諾華公司均采用的是集中生產(chǎn)模式，首先在醫(yī)院中提取患者的T細胞，然后將這些細胞運送至制造中心，在制造中心對T細胞進行基因工程設(shè)計，最后將設(shè)計后的T細胞運回醫(yī)院回輸至患者體內(nèi)。然而，無論使用何種制造模式，成功的CAR-T細胞制造都依賴于端到端流程的優(yōu)化能力，包括工作流程的簡化、產(chǎn)能規(guī)劃以及生產(chǎn)的可擴展性等等。自動化、全封閉的新一代制造工藝是未來發(fā)展趨勢，目前市場上已經(jīng)有一些解決方案，如博雅控股集團旗下的CAR-TXpress、美天旎的CliniMACS Prodigy以及GE公司的FlexFactory 等。（木子鵬）